產(chǎn)品描述

Protein A磁珠為直徑200nm的納米磁珠，表面共價(jià)結(jié)合大量重組Protein A蛋白。納米級磁珠由于高的表面積與體積比，會(huì)提供更多結(jié)合位點(diǎn)，磁珠使用量更少，非特異性吸附率低。重組Protein A 蛋白更適合于結(jié)合mouse IgG2a, IgG2b, IgA, rabbit IgG, 以及human IgG1, IgG2 和IgG4。本產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于細(xì)胞裂解液、細(xì)胞培養(yǎng)上清、血清、腹水等樣品中的抗原免疫沉淀（IP）或免疫共沉淀（Co-IP）。

訂購信息

運(yùn)輸與保存

藍(lán)冰運(yùn)輸。4℃保存，有效期24個(gè)月。注：避免凍融或離心磁珠。

技術(shù)參數(shù)

使用方法

（一）樣本制備

對于貼壁細(xì)胞樣品：

1. 移除培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞兩次。

2. 收集細(xì)胞至1.5 mL EP管內(nèi)，按比例加入IP Lysis/Wash Buffer，同時(shí)加入PMSF等相應(yīng)的抑制劑，混勻后置于冰上靜置5-20min，期間需多次輕輕翻轉(zhuǎn)混合以促進(jìn)細(xì)胞裂解。

3. 在4°C條件下，12000-16000g，10 min離心收集上清液，置于冰上以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)，或存放于-80°C長期保存。

表1.培養(yǎng)皿IP Lysis/Wash Buffer推薦使用體積

對于懸浮細(xì)胞樣品：

1. 在4°C條件下，500-1000g，10min，收集細(xì)胞，棄上清。

2. PBS重懸細(xì)胞，4℃，500-1000g，10 min，收集細(xì)胞，棄上清。

3. 用預(yù)冷的IP Lysis/Wash Buffer重懸細(xì)胞。每50 mg細(xì)胞使用500μL IP Lysis/Wash Buffer。同時(shí)加入PMSF等相應(yīng)的抑制劑，混勻后置于冰上靜置5-20 min，期間需多次輕輕翻轉(zhuǎn)混合以促進(jìn)細(xì)胞裂解。

4. 在4°C條件下，12000 -16000g，10 min離心收集上清液，置于冰上以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)，或存放-80℃長期保存。

對于血清樣品：

通常建議使用IP Lysis/Wash Buffer將血清樣品稀釋至目標(biāo)蛋白的最終濃度介于50至150 µg/mL。稀釋后的樣品可置于冰上以備用，或存放于-20℃以便長期保存。

（二）免疫復(fù)合物的制備

以下實(shí)驗(yàn)方案針對 2-10ug 親和純化的抗體，根據(jù)需要可以按比例放大。

1.   在離心管中將每個(gè)樣品的細(xì)胞裂解液與2-10ug 免疫沉淀抗體結(jié)合。每個(gè)免疫沉淀反應(yīng)推薦的總蛋白量為500-1500ug。

2.   用IP Lysis/Wash Buffer將抗體以及制備好的樣品稀釋至 300-500μL。

3.   在室溫下旋轉(zhuǎn)孵育1-2 h, 或 4℃ 2-4 h，以形成抗體和目標(biāo)蛋白的免疫復(fù)合物。

注：樣品所需的量和孵育時(shí)間均依賴于每個(gè)特定的抗體和抗原體系，因而可能需要優(yōu)化，以達(dá)到效果；建議使用相應(yīng)的同種亞型抗體對照，以便在你的抗體免疫沉淀中顯示特異性結(jié)合。

（三）免疫沉淀

注：為保證磁珠均勻分布，使用前通過反復(fù)顛倒或輕微渦旋混勻瓶中磁珠。

1.   將25-50µL Protein A磁珠加入1.5 mL離心管中。

2.   向磁珠中加入500 µL預(yù)冷PBS，輕柔混勻，使用磁力架分離磁珠，棄去上清。

3.   向離心管中加入200-500 µL IP Lysis/Wash Buffer，顛倒離心管數(shù)次或輕微渦旋混勻1min。用磁力架分離磁珠，棄去上清。

4.   將抗原樣品/抗體免疫復(fù)合物加入裝有磁珠的離心管中，混勻儀上室溫孵育1-2 h，或 4℃，2-4 h。

5.   用磁力架分離磁珠，除去未結(jié)合的樣品，并保存以備分析。

6.   向離心管中加入1000 µL IP Lysis/Wash Buffer，輕柔混勻5-10min，收集磁珠，棄上清。再重復(fù)洗兩次。

7.   變性洗脫：向離心管中加入80-100 µL SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（1×），將樣品置于100℃水浴或者金屬浴中加熱10 min。通過磁力架分離磁珠，收集含有目的抗原的上清進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。注：當(dāng)使用的一抗檢測分子量在50或25kDa范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)時(shí)，建議使用構(gòu)象特異性二抗進(jìn)行檢測，以盡量減少抗體重鏈或輕鏈的干擾；如需保持蛋白活性，也可采用以下洗脫方式：

低pH洗脫：此方法為非變性洗脫法，洗脫的樣品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。向離心管中加入100 µL 洗脫液（0.1M ，pH2.5），混勻在室溫下孵育離心管5-10 min。接著置于磁力架上靜置約30s，待磁吸后，收集上清至新的Ep管，并立即加入20 μL的中和緩沖液（1M Tris-HCl，pH8.0），將洗脫產(chǎn)物pH調(diào)節(jié)至中性，樣品用于后期功能分析。

注意事項(xiàng)

1.   本產(chǎn)品于科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域。

2.   請勿高速離心、干燥或冷凍磁珠，這些操作會(huì)導(dǎo)致磁珠聚集而降低結(jié)合能力。

3.   在免疫共沉淀（IP）實(shí)驗(yàn)中，不同類型的抗體與其對應(yīng)抗原之間的親和力可能有所不同，并且這種結(jié)合效率還可能受到IP Lysis/Wash Buffer的影響。若當(dāng)前實(shí)驗(yàn)步驟未能獲得理想結(jié)果，建議調(diào)整操作細(xì)節(jié)或自行篩選及配制適合的緩沖液，也可使用李記生物相關(guān)試劑，詳見底部。

4.   Protein A、Protein G和Protein A/G與不同種類的免疫球蛋白（Ig）及其亞類的結(jié)合強(qiáng)度表，請?jiān)斠?/p>

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1X PBS (無菌)（貨號：AC08L011）

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蛋白示蹤上樣緩沖液（5 x）（貨號：AP14L036）

本產(chǎn)品于科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域。