產(chǎn)品描述

活性氧（Reactive oxygen species, ROS）包括超氧自由基、過氧化氫、及其下游產(chǎn)物過氧化物和羥化物等，參與細胞生長增殖、發(fā)育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過程。李記生物的活性氧檢測試劑盒（Meilun Reactive Oxygen Species Assay Kit）是一種基于熒光染料DCFH-DA (2,7-Dichlorodi-hydrofluorescein diacetate) 的熒光強度變化，定量檢測細胞內活性氧水平的方法。

DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細胞膜，進入細胞內后，可以被細胞內的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透細胞膜，從而使探針很容易被標記到細胞內。在活性氧存在的條件下，DCFH被氧化生成熒光物質DCF，綠色熒光強度與細胞內活性氧水平成正比，檢測DCF的熒光就可以知道細胞內活性氧的水平。在激發(fā)波長502 nm，發(fā)射波長530 nm附近，使用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、熒光分光光度計、熒光酶標儀、流式細胞儀等檢測DCF熒光，從而測定細胞內活性氧水平。

本試劑盒背景低、靈敏度高、線性范圍寬、使用方便，可用于各種真核培養(yǎng)細胞的檢測，且提供了活性氧陽性對照試劑Rosup，便于活性氧的檢測。以 6 孔板為例，每孔加樣量為1mL時，本試劑盒可測定約 100 次，96孔板約為1000次（每孔100μl）。

訂購信息

產(chǎn)品組分

運輸與保存

藍冰運輸。-20℃避光保存，有效期12個月。

使用方法

一、裝載探針

刺激時間較短（通常為2 h以內）的細胞：先裝載探針，后用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細胞。

刺激時間較長（通常為6 h以上）的細胞：先用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細胞，后裝載探針。

1.     原位裝載探針（僅適用于貼壁細胞）

(1)   細胞準備：檢測前一天進行細胞鋪板，確保檢測時細胞匯合度達到50~70%?！咀ⅰ浚罕仨毐ＷC細胞狀態(tài)健康，且檢測時不會過度生長。

(2)   探針準備：探針裝載前按照1:1000 用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μM。

(3)   探針裝載：吸除細胞培養(yǎng)液，加入適當體積稀釋好的DCFH-DA 工作液。加入的體積以能充分蓋住細胞為宜，【例】：6 孔板通常不少于1000 μL；96 孔板通常不少于100 μL。37℃細胞培養(yǎng)箱內避光孵育20~30 min。

(4)   細胞清洗：用無血清培養(yǎng)液洗滌細胞3 次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。

(5)   藥物誘導：加入適量經(jīng)合適的緩沖液或無血清培養(yǎng)基稀釋到工作濃度的藥物，于37℃細胞培養(yǎng)箱內避光孵育，具體誘導時間根據(jù)藥物本身特性，以及細胞類型來決定。

(5)（可選）陽性對照：先用無血清培養(yǎng)基等1:1000 稀釋陽性對照（Rosup, 50mg/ml）到常用工作濃度100 μg/ml，加入細胞，一般37℃避光孵育20~30 min 可顯著看到活性氧水平提高，但依細胞類型會有比較明顯差異。（如，HeLa 細胞孵育30 min；MRC5人胚胎成纖維細胞1.5 h）

2.     收集細胞后裝載探針（適用于貼壁細胞和懸浮細胞）

(1)   細胞準備：按照標準方法培養(yǎng)細胞，必須保證檢測用細胞狀態(tài)健康。按照適當方法，清洗并收集足量的細胞。

(2)   探針準備：探針裝載前，按照1:1000 用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μM。

(3)   探針裝載：細胞收集后懸浮于加入適當體積稀釋好的DCFH-DA 工作液，使其細胞密度為1.0×106~2.0×107/mL，37℃細胞培養(yǎng)箱內避光孵育20~30 min，每隔3-5 min 顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸?！咀ⅰ浚杭毎芏刃韪鶕?jù)后續(xù)的檢測體系，檢測方法，以及檢測總量來進行調整?！纠浚簩τ诹魇椒治觯瑔喂軝z測內細胞數(shù)目不少于104，也不可多于106。

(4)   細胞清洗：用無血清培養(yǎng)液洗滌細胞3 次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。

(5)   藥物誘導：將細胞懸浮于適量經(jīng)合適的緩沖液或無血清培養(yǎng)基稀釋到工作濃度的藥物中，或把細胞等分成若干份后進行藥物刺激，于37℃細胞培養(yǎng)箱內避光孵育，具體誘導時間按藥物本身特性，以及細胞類型來決定。

(5)（可選）陽性對照：先用無血清培養(yǎng)基等1:1000 稀釋陽性對照（Rosup, 50mg/ml）到常用工作濃度100 μg/ml，加入細胞，一般37℃避光孵育20~30 min 可顯著看到活性氧水平提高，但依細胞類型會有比較明顯差異。（如，HeLa 細胞孵育30 min；MRC5人胚胎成纖維細胞1.5 h）

二、檢測

原位裝載探針法：激光共聚焦顯微鏡直接觀察，或收集細胞后用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測。

收集細胞后裝載探針：用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測，也可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察。

三、參數(shù)設置

使用488 nm 激發(fā)波長，525 nm 發(fā)射波長，實時或逐時間點檢測刺激前后熒光的強弱。DCF 的熒光光譜和FITC 非常相似，可以用FITC 的參數(shù)設置檢測DCF。DCF 的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜參考下圖。

四、其他事項說明

1.     陽性對照Rosup通常按照1:1000的比例使用。通常刺激后20~30 min可以觀察到顯著的活性氧水平升高。對于不同的細胞，活性氧陽性對照的效果可能有較大的差別。如果在刺激后30 min內觀察不到活性氧的升高，可延長誘導時間或適當提高活性氧陽性對照的濃度。如果活性氧升高得過快，可縮短誘導時間或適當降低活性氧陽性對照的濃度。

2.     對于某些細胞，若沒有刺激的陰性對照細胞熒光也比較強，可以按照1:2000～1:5000稀釋DCFH-DA，使裝載探針時DCFH-DA 的濃度為2～5 μM。探針裝載的時間也可以根據(jù)情況在15～60 min內適當進行調整。

3.     活性氧陽性對照（Rosup）僅僅用于作為陽性對照的樣品，并不是在每個樣品中都需加入活性氧陽性對照。

注意事項

1. 本產(chǎn)品于科學實驗研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領域。

2. 探針裝載后，一定要洗凈殘余的未進入細胞內的探針，否則會導致背景較高。

3. 探針裝載完畢并洗凈殘余探針后，可以進行激發(fā)波長的掃描和發(fā)射波長的掃描，以確認探針的裝載情況是否良好。DCF 的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜請參考上頁圖譜。

4. 盡量縮短探針裝載后到測定所用的時間（刺激時間除外），以減少各種可能的誤差。

本產(chǎn)品于科學實驗研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領域。