CCK-8試劑盒（Cell Counting Kit-8）

產(chǎn)品描述

CCK-8試劑盒，是一種基于WST-8（化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽）而廣泛應(yīng)用于細胞增殖和細胞毒性的快速、高靈敏度的比色檢測試劑盒。檢測原理為：WST-8在電子耦合劑1-Methoxy PMS存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的水溶性的甲臜（formazan，參考圖1)，生成的甲臜的顏色深淺與細胞增殖成正比，與細胞毒性成反比。使用酶標(biāo)儀在450nm 波長處測定OD 值，間接反映活細胞數(shù)量。

本試劑盒可用于細胞增殖測定，細胞毒性的檢測，藥物篩選，以及細胞生長抑制檢測等。

圖1：WST-8分子結(jié)構(gòu)及檢測原理

訂購信息

運輸與保存

藍冰運輸。4℃短期保存，有效期6個月；-20℃長期保存，有效期24個月。【注】：反復(fù)凍融會造成測定背景OD值升高。

CCK-8試劑盒（Cell Counting Kit-8）使用方法

1.       以96孔板為例，96孔板中每孔接種100 μL的細胞懸液，在細胞培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h。

2.       向每孔加入10 μL不同濃度的待測物質(zhì)。如果僅測定細胞活性，則不需要2~3步驟，直接從第4步操作。

3.       將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r間（依據(jù)待測藥物而定）。

4.       向每孔加入10 μL CCK-8溶液（注意不要產(chǎn)生氣泡，輕輕混勻）。

5.       將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育適當(dāng)時間（一般0.5~2 h）。

6.       酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光值。

細胞活力計算

細胞存活率*（%）=[(As-Ab) / (Ac-Ab)] × 100%

抑制率*（%）=[1-(As-Ab) / (Ac-Ab)] × 100%

As: 實驗孔吸光度(含細胞、培養(yǎng)基、CCK-8 溶液和藥物溶液)；

Ac: 對照孔吸光度 (含細胞、培養(yǎng)基、CCK-8 溶液，不含藥物) ；

Ab: 空白孔吸光度 (含培養(yǎng)基、CCK-8 溶液，不含細胞、藥物) 。

注意事項

1.       本產(chǎn)品僅限于科學(xué)實驗研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域。

2.       建議調(diào)試合適的接種細胞的數(shù)量和加入CCK-8溶液后培養(yǎng)的時間。當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)96 孔板時，貼壁細胞至少1000 個/ 孔(100 μL 培養(yǎng)基)，白細胞至少2500 個/ 孔(100 μL 培養(yǎng)基)。建議實驗前設(shè)定幾個不同細胞數(shù)量的梯度孔進行條件測試，細胞培養(yǎng)時間和處理方法根據(jù)實驗情況而定，加入CCK-8溶液后（加入體積為每孔細胞培養(yǎng)液體積的10%），在37℃細胞培養(yǎng)箱中孵育，不同時間點后測450 nm處的吸光值(CCK-8敏感性高，一些細胞0.5 h后就可以測定第一次)。

3.       CCK-8試劑盒的檢測依賴于脫氫酶催化反應(yīng)，如果待檢測體系中有較多還原劑（或抗氧化劑）會造成背景OD值升高，干擾檢測結(jié)果。如果實驗中有還原劑，請檢查背景的OD值，設(shè)法先去除還原劑干擾。例如，可在加入CCK-8溶液之前更換新鮮的培養(yǎng)基，以去除待測藥物的影響。當(dāng)待測藥物影響比較小時，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入待測藥物后的空白吸收即可。

4.       進行藥物抑制實驗時，如果藥物中含有金屬，如Pb2+、Fe2+、Cu2+等金屬會對CCK-8 Solution的顯色反應(yīng)產(chǎn)生影響，從而導(dǎo)致檢測的靈敏度降低。

5.       如果細胞培養(yǎng)時間較長，培養(yǎng)基顏色發(fā)生變化，應(yīng)洗滌細胞更換培養(yǎng)基后再加CCK-8檢測。細胞培養(yǎng)基酚紅不影響測定結(jié)果。

6.       為使CCK-8試劑盒培養(yǎng)基充分混勻，減少CCK-8在移液器上的殘留，建議加樣前用培養(yǎng)基稀釋CCK-8試劑，混勻后加樣。

7.       若暫時不測定OD值，可以向每孔中加入0.1 M 的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，室溫避光保存，24 h 內(nèi)檢測，吸光度不會受到影響（加入1% SDS 溶液的體積與加入CCK-8溶液的體積相同）。

8.       如果吸光值很低，可以適當(dāng)增加細胞數(shù)量或者延長加入CCK-8溶液后孵育的時間。

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